A cura di Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, approvato il 25 dicembre 2020 (revisionato il 25 ottobre 2020)
Riportiamo l'interazione tra subunità nella replica dei complessi di trascrizione dei coronavirus, che sono essenziali per la replicazione e la conservazione evolutiva.Abbiamo fornito prove che il dominio NiRAN associato a nsp12 ha attività di transferasi nucleosidica monofosfato (NMP) in trans e abbiamo identificato nsp9 (una proteina legante l'RNA) come bersaglio.NiRAN catalizza l'attacco covalente della porzione NMP all'ammino terminale conservato di nsp9 in una reazione che si basa sugli ioni Mn2+ e sui residui Asn conservati adiacenti.È stato scoperto che l’attività NiRAN e la NMPilazione nsp9 sono essenziali per la replicazione del coronavirus.I dati ci consentono di collegare questa attività del marcatore enzimatico virale annidato alle osservazioni precedenti nell'ipotesi che l'inizio della sintesi di RNA in una classe di virus a RNA sia funzionalmente ed evolutivamente coerente.
La RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRps) dei Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae e altre 12 famiglie) è collegata al dominio amminoterminale (N-terminale) nella proteina non strutturale (nsp) rilasciata dalla poliproteina, chiamata NiRAN 1ab è composto dalla proteasi principale virale (Mpro).In precedenza, è stata segnalata l'attività GMPilazione/UMPilazione del virus arterioso NiRAN-RdRp nsp ed è stato suggerito di generare un transitorio per il trasferimento del nucleoside monofosfato (NMP) al virus (attualmente sconosciuto) e/o agli oggetti di biopolimerizzazione cellulare.Qui, mostriamo che il coronavirus (coronavirus umano [HCoV]-229E e sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ha attività di NMPilazione Mn2+-dipendente, che deriva da nsp9 attraverso la formazione di nsp9 mediata da Mpro. la nsps fiancheggiante N-terminale viene rilasciata proteoliticamente, il fosforammidato è legato all'ammina primaria (N3825) all'N-terminale di nsp9.L'uridina trifosfato è il nucleotide preferito in questa reazione, ma anche l'adenosina trifosfato, la guanosina trifosfato e la citidina trifosfato sono co-substrati adatti.Studi di mutazione utilizzando proteine ricombinanti nsp9 e nsp12 del coronavirus e mutanti HCoV-229E geneticamente modificati hanno determinato i residui necessari per la NMPilazione nsp9 mediata da NiRAN e la replicazione del virus nella coltura cellulare.I dati hanno confermato la previsione dei residui del sito attivo NiRAN e hanno determinato l'importante ruolo dei residui nsp9 N3826 nella NMPilazione nsp9 e nella replicazione del virus in vitro.Questo residuo fa parte della sequenza tripeptide NNE N-terminale conservata e si è rivelato l’unico residuo invariante di nsp9 e dei suoi omologhi nella famiglia dei coronavirus.Questo studio fornisce una solida base per lo studio funzionale dell'attività di NMPilazione di altri virus annidati e propone possibili bersagli per lo sviluppo di farmaci antivirali.
Il virus a RNA a filamento positivo Nidovirales infetta una varietà di vertebrati e invertebrati (1, 2).L’ordine comprende attualmente 14 famiglie (3), di cui la famiglia Coronavirus è stata ampiamente studiata negli ultimi 20 anni.A quel tempo, tre coronavirus zoonotici emersero da ospiti animali e causarono epidemie su larga scala di gravi infezioni respiratorie negli esseri umani.Comprese le pandemie persistenti causate da gravi malattie infettive acute.Sindrome respiratoria Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).I nidovirus condividono un'organizzazione genomica comune e la subunità del complesso di replicazione-trascrizione (RTC) legato alla membrana è codificata nei due terzi del terminale 5-?² e nella subunità strutturale principale della particella virale, nonché in alcuni accessori .Proteina, codificata nel terzo terminale 3??² del genoma (1).Ad eccezione di una famiglia di virus planari (Monoviridae) (8), tutti i virus nidificati codificano le subunità RTC in due grandi frame di lettura aperti (ORF) ORF1a e ORF1b, che sono tradotti dall'RNA genomico di.ORF1a codifica la poliproteina (pp) 1a e ORF1a e ORF1b codificano congiuntamente pp1ab.Con la partecipazione generale della proteasi principale (Mpro) codificata da ORF1a, sia pp1a che pp1ab vengono processati proteoliticamente in una varietà di proteine non strutturali (nsps), note anche come 3CLpro, perché hanno omologia con la 3Cpro del picornavirus ( 9).Si ritiene che queste nsps siano assemblate in un grande RTC dinamico, catalizzano la sintesi dell'RNA genomico (replicazione) e di un insieme di RNA subgenomico (trascrizione) e sono utilizzati per coordinare l'espressione dell'ORF situato a valle di ORF1b (10? ? ?12).
Il nucleo RTC comprende la RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) (13), la superfamiglia 1 elicasi (HEL1) (14, 15) e diversi enzimi di elaborazione dell'RNA, che sono principalmente codificati in ORF1b e nella famiglia dei coronavirus. Contiene nsp12-nsp16 e nsp9-nsp12 nella famiglia Arterioviridae (vedi riferimento 10ââ 12).RdRp e HEL1 rappresentano due (un quinto) domini conservati del virus del nido d'uccello e hanno omologia con altri virus a RNA.Si ritiene che la replicasi del core sia assistita da altre subunità, tra cui diversi piccoli nsps rilasciati dalla regione carbossiterminale (C-terminale) di pp1a, a valle di Mpro (coronavirus nsp5 e virus arterioso nsp4, rispettivamente).Hanno una protezione specifica della famiglia limitata e attività diversificate (riviste nel riferimento 10-12).
Relativamente recentemente, un dominio con caratteristiche di motivo di sequenza uniche è stato trovato all'estremità amminica (N-terminale) adiacente a RdRp in tutti i virus nidificati, ma in nessun altro virus a RNA (16).In base alla sua posizione e all'attività della nucleotide transferasi (nucleoside monofosfato [NMP] transferasi), questo dominio è denominato NiRAN (nucleotide transferasi correlata a Nestvirus RdRp).La combinazione a doppio dominio di NiRAN-RdRp costituisce nsp12 nella famiglia Coronaviridae e nsp9 nella famiglia Arterioviridae, e in altri nestoviridae, si prevede che NiRAN-RdRp venga rilasciato come nsp indipendente dalla poliproteina virale.Nel coronavirus, il dominio NiRAN contiene ??1/450 di residui ed è collegato al dominio RdRp C-terminale attraverso la regione di collegamento (16?19).Nel virus dell'arterite equina (EAV) (Arteriviridae), nsp9 ricombinante mostra attività di UMPilazione e GMPilazione (auto) dipendenti dagli ioni Mn2+, che dipendono da tre basi di sequenza conservate in Nestovirus, AN, BN e CN I residui nella sequenza.Dove N sta per NiRAN) (16).Il fiancheggiamento N-terminale di questi motivi è un motivo preAN meno conservativo.Alcuni di questi residui sono anche conservati in proteine chinasi lontanamente correlate, dove è stato dimostrato che sono coinvolti nel legame del nucleoside trifosfato (NTP) e nell'attività catalitica (20, 21).Coerentemente con questa osservazione, diversi residui chiave del sito attivo nella pseudochinasi SelO di Pseudomonas syringae possono essere assemblati con il supercomplesso SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 recentemente pubblicato.Residui conservati di NiRAN di Coronavirus sovrapposti alla microstruttura elettronica.Proteina ricombinante (17).Si ipotizza che la documentata (auto) U/GMPilazione produrrà uno stato transitorio per trasferire l'NMP al substrato (attualmente sconosciuto) (16), e la somiglianza strutturale tra NiRAN e la proteina chinasi (17, 19) è l'ipotesi che NiRAN modifica altre proteine.
Molte caratteristiche, tra cui la sua associazione sistematica unica e unica con virus nidificati e la separazione genetica da RdRp, rendono NiRAN un enzima regolatore chiave ragionevole per i virus nidificati, che è fondamentale per la loro emergenza e identità.In precedenza, venivano chiamate tre possibili funzioni che coinvolgevano NiRAN per regolare la traduzione o la replicazione/trascrizione del genoma/subgenomico.Se si considerano i dati scarsi e incompleti disponibili al momento, ciascuna funzione presenta vantaggi e svantaggi (16).In questa ricerca, miriamo a combinare gli studi biochimici e genetici inversi dei coronavirus che rappresentano i due generi e a inserire le nostre scoperte nel contesto evolutivo della mutazione naturale della famiglia dei coronavirus, in modo da ottenere informazioni dettagliate su questo regno misterioso.Riportiamo importanti progressi nella comprensione di NiRAN attraverso l'identificazione di bersagli naturali in RTC, che (tra le tre ipotesi disponibili) contribuisce al ruolo di questo dominio nell'avviare la sintesi dell'RNA del virus nidificato.Questa ricerca apre anche possibilità per altri ruoli di NiRAN sull’interfaccia dell’ospite del virus.
Al fine di caratterizzare le proprietà enzimatiche del dominio NiRAN correlato a nsp12 del virus corona, abbiamo prodotto una forma ricombinante di coronavirus umano 229E (HCoV-229E) nsp12 in E. coli, con un tag His6 al C-terminale, e abbiamo combinato il dominio NiRAN correlato a nsp12 del corona virus. proteina con [α32-P] Incubare insieme a NTP in presenza di MnCl2 come descritto in Materiali e metodi.L'analisi del prodotto di reazione ha indicato la presenza di una proteina radiomarcata che comigra con nsp12 (106 kDa), indicando che il coronavirus nsp12 catalizza la formazione di addotti covalenti proteina-NMP, formati preferenzialmente con uridina monofosfato (UMP) (Figura 1A) e B).L'analisi quantitativa ha mostrato che, rispetto ad altri nucleotidi, l'intensità del segnale dell'incorporazione dell'UMP è aumentata da 2 a 3 volte (Figura 1C).Questi dati sono coerenti con l’attività prevista della transferasi NMP del dominio NiRAN del coronavirus (16), ma indicano che le preferenze nucleotidiche del dominio NiRAN del coronavirus e del virus arterioso sono diverse.
Attività di auto-NMPilazione di HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) è stato incubato con l'NTP [α-32P] designato in presenza di MnCl2 6 mM per 30 minuti (vedere Materiali e metodi per i dettagli).I prodotti di reazione sono stati separati mediante SDS-PAGE e colorati con Coomassie blu brillante.(B) La proteina radiomarcata viene visualizzata mediante imaging del fosforo.Le posizioni di nsp12-His6 e dei marcatori di massa molecolare delle proteine (in kilodalton) sono mostrate in A e B. (C) L'intensità del segnale radioattivo (media ± SEM) è stata determinata da tre esperimenti indipendenti.*P≤0,05.La potenza del segnale (percentuale) è correlata all'UTP.
Sebbene le attività enzimatiche correlate a NiRAN abbiano dimostrato di essere essenziali per la replicazione di EAV e SARS-CoV in colture cellulari (16), la funzione specifica di NiRAN e i potenziali bersagli non sono ancora stati determinati.La somiglianza strutturale recentemente riportata tra NiRAN e una famiglia di proteine con pieghe simili alla proteina chinasi (17, 22) ci ha spinto a testare l'ipotesi che NiRAN catalizza la NMPilazione di altre proteine.Abbiamo generato una serie di potenziali target omologhi, comprese proteine non strutturali codificate da HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), ciascuna contenente un tag His6 C-terminale (appendice SI, Tabella S1) e incubare queste proteine con [α32-P] uridina trifosfato ([α32-P]UTP) in presenza o assenza di nsp12.L'albumina sierica bovina e la proteina di fusione MBP-LacZα prodotta in E. coli sono servite da controlli (Figura 2A, corsie da 1 a 7).La proteina radiomarcata è stata analizzata mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e autoradiografia e si è riscontrato che era presente un forte segnale radioattivo nella reazione contenente nsp12 e nsp9.La posizione del segnale corrisponde alla massa molecolare di nsp9, indicando l'UMpilazione mediata da nsp12 di nsp9 (Figura 2B, traccia 7).Nessun'altra proteina del test è risultata UMPilata, il che ci ha portato a concludere che nsp9 è un substrato specifico di nsp12.Coerentemente con i dati di auto-NMPilazione mostrati nella Figura 1, nsp12 è in grado di trasferire tutti e quattro gli NMP a nsp9, sebbene l'efficienza sia diversa, UMP> adenosina monofosfato (AMP)> guanosina monofosfato (GMP)> citidina monofosfato (CMP)) ( Immagine).3A e B).Nelle condizioni utilizzate in questo test (abbreviare il tempo di reazione e di esposizione, ridurre la concentrazione di nsp12; materiali e metodi), non è stato possibile rilevare l'auto-NMPilazione di nsp12 (confrontare Figura 2B, corsia 7 e Figura 1B), che si è rivelato un UMP efficace (e più round) spostato da nsp12 a nsp9.L'attività della transferasi UMP richiede la presenza di ioni Mn2+, come mostrato nella Figura 3C, mentre è stata osservata solo un'attività minima della transferasi UMP in presenza di Mg2+ e nessuna attività in presenza degli altri due cationi bivalenti testati.Dati simili sono stati ottenuti in test di NMPilazione contenenti citidina trifosfato (CTP), guanosina trifosfato (GTP) e adenosina trifosfato (ATP) (appendice SI, Figura S1).
UMPilazione mediata da HCoV-229E nsp12 di nsp9.Una serie di substrati proteici (tra cui albumina sierica bovina, MBP-lacZα e una serie di nsps HCoV-229E marcati con His6 C-terminale codificato da ORF1a) sono stati utilizzati per valutare l'attività di UMPilazione di HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediata proteina.Incubare la proteina con [α-32P] UTP per 10 minuti in assenza (A) o presenza (B) di nsp12 come descritto nei materiali e nei metodi.Nella parte superiore di A e B è mostrato il gel SDS-poliacrilammide colorato con Coomassie Brilliant Blue, mentre nella parte inferiore di A e B sono mostrati i corrispondenti autoradiogrammi.La posizione del marcatore di massa molecolare della proteina (in kilodalton) è riportata a sinistra.Sono inoltre indicati la posizione di nsp12-His6 (B, in alto) e il segnale radioattivo osservato durante l'incubazione di nsp12-His6 con nsp9-His6 (B, corsia 7), il che indica che [α-32P]UMP a nsp9-His6 (12,9 kDa), che non è stato osservato per altre proteine testate.
Caratterizzazione biochimica e virologica mediata da HCoV-229E NiRAN della NMPilazione di nsp9.(A e B) Il ruolo del co-substrato nucleotidico utilizzato nella reazione.Nsp12-His6 e nsp9-His6 vengono miscelati e incubati in presenza di diversi NTP [α-32P] nel test di NMPilazione standard.(A, in alto) nsp9-His6 colorato con Coomassie separato da SDS-PAGE.(A, in basso) Autoradiografia della stessa area del gel.(B) L'attività relativa (media ± SEM) in presenza del cofattore nucleotidico designato è determinata da tre esperimenti indipendenti.*P≤0,05.(C) Il ruolo degli ioni metallici.Viene mostrato il test standard di NMPilazione in presenza di [α-32P] UTP e diversi ioni metallici, ciascuno con una concentrazione di 1 mM.In C, in alto, viene mostrato nsp9-His6 colorato con Coomassie, e in C, in basso, viene mostrata l'autoradiografia corrispondente.La dimensione della proteina marcata (in kilodalton) è mostrata a sinistra di A e C. (D) La forma mutante di HCoV-229E nsp12-His6 che trasporta la sostituzione amminoacidica specificata è in [α-32P]UTP, come descritto in Materiali e Metodi.Il nsp9-His6 radiomarcato prodotto nella reazione di NMPilazione viene rilevato mediante imaging di fosforilazione (D, in alto).L'attività relativa rispetto alla proteina wild-type (wt) è mostrata in D, e il fondo è preso come media (± SEM) da tre esperimenti indipendenti.Gli asterischi indicano sostituzioni di residui non conservati.(E) Il titolo del virus nel surnatante della coltura delle cellule p1 ottenuto 24 ore dopo l'infezione è stato determinato mediante dosaggio della placca.Sono indicate le sostituzioni del codone nel dominio NiRAN del mutante HCoV-229E ingegnerizzato (la numerazione dei residui si basa sulla loro posizione in pp1ab).Il mutante del sito attivo RdRp carente di replicazione nsp12_DD4823/4AA è stato utilizzato come controllo.
Per ottenere una comprensione più profonda del sito attivo di NiRAN e determinare i residui correlati all'attività della NMP transferasi specifica per nsp9, abbiamo eseguito un'analisi delle mutazioni, in cui abbiamo sostituito i residui conservativi nei motivi NiRAN AN, BN e CN ( 16) È Ala (appendice SI, Figura S2).Inoltre, in due casi è stato valutato l'impatto delle sostituzioni conservatrici Arg-to-Lys o Lys-to-Arg.Come controllo (negativo), i residui che non sono o meno conservati nel dominio NiRAN dei coronavirus e di altri virus annidati vengono sostituiti con Ala. In sostituzione di K4116A (nel motivo preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motivo BN) e D4280A (CN) riducono significativamente o addirittura eliminano la NMPilazione di nsp9 attraverso nsp12, mentre le proteine con sostituzioni conservatrici (R4178K), K4116R) mantengono il 60% e l'80% della loro attività, il che indica che l'allentamento delle restrizioni sui rispettivi lati le catene sono fisico-chimicamente sensibili (Figura 3D).La sostituzione di molti altri residui conservati E4145A, D4273A, F4281A e D4283A è molto meno dannosa e l'UMpilazione di nsp9 è solo moderatamente ridotta.Risultati simili sono stati ottenuti nelle reazioni di NMPilazione nsp9 che coinvolgono altri NTP (Figura 3D e appendice SI, Figura S3), confermando che gli effetti osservati su specifiche sostituzioni di amminoacidi sono indipendenti dal tipo di co-substrato nucleotidico utilizzato.Successivamente, abbiamo testato il possibile impatto di queste sostituzioni nsp12 sulla replicazione dei coronavirus nelle colture cellulari.A tal fine, abbiamo utilizzato appropriati modelli di DNA complementare (cDNA) geneticamente modificati clonati nel virus vaccinico ricombinante (23, 24) per trascrivere 5 -7 cellule.La titolazione della progenie del virus infettivo prodotto in queste cellule ha mostrato che la maggior parte dei mutanti NiRAN HCoV-229E non erano fattibili (Figura 3E).Un gruppo di mutanti virali non vitali comprende alternative che hanno dimostrato di eliminare o ridurre significativamente l'attività della transferasi NMP in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ma esistono altre due alternative (K4116R, E4145A)80 % riservato?La loro attività di NMPilazione in vitro suggerisce che siano coinvolte ulteriori restrizioni.Allo stesso modo, altre due mutazioni (R4178K, F4281A) che hanno causato una moderata diminuzione dell'attività di NMPilazione in vitro di NiRAN hanno prodotto virus vivi, tuttavia, questi virus hanno ridotto significativamente i titoli attraverso la replicazione.Coerentemente con i dati di attività in vitro mostrati nella Figura 3D, la sostituzione di altri quattro residui che non sono conservati nel coronavirus e/o in altri virus annidati (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ha prodotto virus vitali La prole, nonostante avesse un titolo moderatamente ridotto rispetto al virus di tipo selvaggio (Figura 3E).
Per studiare se l'attività della transferasi NMP mediata da NiRAN dipende dal dominio RdRp attivo, i due residui Asp conservati coinvolti nella coordinazione degli ioni metallici bivalenti (11) nel motivo C RdRp sono stati sostituiti da Ala. La proteina risultante nsp12_DD4823/4AA conserva la sua attività di NMPilazione nsp9, indicando che l'attività di NMPilazione nsp9 in vitro mediata da nsp12 non richiede l'attività della polimerasi (Appendice SI, Figura S4).
Dopo aver stabilito l'attività della transferasi NMP specifica per nsp9 per nsp12, abbiamo cercato di caratterizzare l'addotto NMP-nsp9 mediante spettrometria di massa (MS).Lo spettro di massa proteica completo dell'HCoV-229E nsp9 ricombinante ha mostrato un picco a 12.045 Da (Figura 4A).L'aggiunta di nsp12 non ha modificato la qualità di nsp9, indicando che nsp12 e nsp9 non formerebbero un complesso stabile nelle condizioni utilizzate (denaturazione) (Figura 4A).In presenza di UTP e GTP, la misurazione della massa della reazione contenente rispettivamente nsp9 e nsp12 ha mostrato che la massa proteica di UTP si è spostata di 306 Da e la massa proteica di GTP si è spostata di 345 Da, indicando che ciascuna molecola nsp9 si lega a UMP o GMP (Figura 4) C e D).Si ipotizza che l'energia richiesta per la NMPilazione di nsp9 mediata da NiRAN provenga dall'idrolisi dell'NTP e dal rilascio di pirofosfato.Sebbene in questa reazione sia stato utilizzato un eccesso molare di 10 volte di nsp9 (bersaglio) rispetto a nsp12 (enzima), è stata osservata una NMPilazione quasi completa di nsp9, indicando che l'interazione tra nsp12 e nsp9 è di breve durata e nsp12 può NMPilare più nsp9 molecola in vitro.
Singola NMPilazione di nsp9 in presenza di nsp12 e UTP o GTP.Viene mostrato lo spettro di massa proteica completo deconvoluto di HCoV-229E nsp9 (appendice SI, Tabella S1) (AD).(A) nsp9 da solo, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 in presenza di UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 in presenza di GTP.
Per determinare i residui nsp9 UMPilati da nsp12, nsp9-UMP è stato scisso con trypsin.I peptidi risultanti sono stati separati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e analizzati mediante spettrometria di massa tandem (MS/MS) online.L'analisi dei dati utilizzando il pacchetto software Byonic (Protein Metrics) ha mostrato la UMPilazione dell'amminoacido N-terminale.Ciò viene confermato manualmente.Lo spettro di massa tandem del peptide precursore [UMP]NNEIMPGK (appendice SI, Figura S5A) ha rivelato un frammento a 421 m/z, indicando che UMP si lega al residuo 1 di nsp9.
All'N-terminale di nsp9, Asn è conservato tra i membri di Orthocoronavirinae (appendice SI, Figura S6).Sebbene riteniamo che l'azoto amminico primario N-terminale sia l'accettore più probabile per l'UMP, abbiamo deciso di ottenere ulteriori prove del legame dell'NMP all'N-terminale.Per questo motivo, il peptide N-terminale nsp9 non NMPilato e NMPilato purificato mediante HPLC è stato derivato in presenza di acetone e cianoboroidruro di sodio.In queste condizioni, solo le ammine primarie libere possono essere modificate con propile (25).Il peptide N-terminale derivato da nsp9 con la sequenza NNEIMPGK contiene due ammine primarie, una all'N-terminale di Asn e l'altra alla catena laterale di Lys al C-terminale.Pertanto, i gruppi propilici possono essere introdotti ad entrambe le estremità.I cromatogrammi ionici estratti dei peptidi non NMPilati sono mostrati nell'appendice SI, Figura S5B.Come previsto, è possibile identificare peptidi (mono)propilati N-terminali e C-terminali (appendice SI, Figura S5B, corsia superiore) e dipropilati (appendice SI, Figura S5B, corsia inferiore).Questo modello cambia con l'uso del peptide N-terminale NMPilato di nsp9.In questo caso, possono essere identificati solo i peptidi propilati C-terminali, ma i peptidi propilati N-terminali e i peptidi dipropilati non sono identificati (Appendice SI, Figura S5C), indicando che l'UMP è stato trasferito all'ammina primaria N-terminale. Per evitare ciò gruppo dall'apportare modifiche.
Successivamente, sostituiamo (con Ala o Ser) o eliminiamo i residui conservati all'N-terminale di nsp9 per definire i vincoli specifici del target.Sulla base dei nostri dati MS che mostrano che NiRAN forma un addotto nsp9-NMP con l'ammina primaria del residuo N-terminale di nsp9, abbiamo ipotizzato che l'NMPilazione di nsp9 richieda la proteasi virale principale (Mpro, nsp5) per rilasciare il terminale Nsp9 da il suo precursore poliproteico.Per verificare questa ipotesi, abbiamo prodotto una proteina precursore nsp7-11 contenente nsp9 in E. coli ed eseguito un test standard di NMPilazione in presenza di [α-32P] UTP (materiali e metodi).Come mostrato nella Figura 5A (corsia 3), il precursore nsp7-11 non tagliato non è radiomarcato con nsp12.Al contrario, se nsp7-11 viene scisso da nsp5 ricombinante per rilasciare nsp9 (e altri nsps) dal precursore, viene rilevata una proteina radiomarcata che migra con nsp9, confermando la nostra conclusione che NiRAN e la formazione N-selettiva di addotti covalenti nsp9-NMP .L'ammina primaria terminale dell'N-terminale Asn (posizione 3825 in pp1a/pp1ab).Questa conclusione è supportata anche da esperimenti che utilizzano il costrutto nsp9, che contiene uno o due residui aggiuntivi all'N-terminale.In entrambi i casi, l'UMpilazione di nsp9 mediata da NiRAN è stata abolita (Appendice SI, Figura S7).Successivamente, abbiamo prodotto una proteina con uno o due residui Asn eliminati dalla sequenza peptidica 3825-NNEIMPK-3832 all'N-terminale di nsp9.In entrambi i casi, la UMPilazione di nsp9 è stata completamente bloccata (Figura 5B), fornendo ulteriori prove del fatto che il vero N-terminale di nsp9 agisce come un recettore NMP.
L'elaborazione proteolitica di nsp9 e il ruolo dei residui N-terminali nella UMPilazione mediata da nsp12.(A) UMPylation nsp9 richiede un N-terminale nsp9 libero.Nsp7-11-His6 è pre-incubato a 30 °C nel tampone di rilevamento NMPilazione contenente UTP in presenza o assenza di Mpro ricombinante (nsp5-His6).Dopo 3 ore, avviare il test di NMPilazione aggiungendo nsp12-His6 come descritto in Materiali e metodi.La reazione contenente nsp5-His6 (corsia 1) e nsp9-His6 (corsia 2) è stata utilizzata come controllo.Dopo 10 minuti, la reazione è stata interrotta e la miscela di reazione è stata separata mediante SDS-PAGE.La proteina è stata colorata con Coomassie Brilliant Blue (A, in alto).Il precursore Nsp7-11-His6 e il prodotto trasformato risultante dalla scissione mediata da nsp5-His6 sono mostrati a destra.Si prega di notare (a causa delle loro piccole dimensioni) che nsp7 e nsp11-His6 non sono rilevabili in questo gel e la reazione è integrata con nsp5-His6 (corsie 1 e 4; la posizione di nsp5-His6 è indicata da un cerchio pieno) o nsp9-His6 (corsia 2) contiene una piccola quantità di MBP (indicata da cerchi aperti) come impurità residue perché sono espresse come proteine di fusione MBP (appendice SI, Tabella S1).(B) La variante Nsp9-His6 è priva di uno o due residui Asn N-terminali (numerazione dei residui in base alla posizione in pp1a/pp1ab) ed è purificata e incubata con nsp12-His6 e [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE colorata con Coomassie è mostrata in alto, B, l'autoradiografo corrispondente è mostrato in basso.La posizione del marcatore del peso molecolare (in kilodalton) è mostrata a sinistra.(C) I residui conservati N-terminali di HCoV-229E nsp9-His6 sono stati sostituiti con Ala o Ser e la stessa quantità di proteina è stata utilizzata nella reazione di UMPylazione mediata da nsp12-His6.I prodotti di reazione sono stati separati mediante SDS-PAGE e colorati con Coomassie Brilliant Blue (C, in alto) e nsp9-His6 radiomarcato è stato rilevato mediante imaging a fosforescenza (C, al centro).Utilizzando la proteina wild-type (peso) come riferimento (impostata al 100%), l'attività relativa di NMPilazione (media ± SEM) è stata calcolata da tre esperimenti indipendenti.(D) I titoli virali nel surnatante della coltura cellulare p1 di cellule Huh-7 infettate con cellule Huh-7 di tipo selvaggio HCoV-229E e i mutanti che trasportano sostituzioni di amminoacidi designate in nsp9 sono stati determinati mediante test su placca.Il doppio mutante DD4823/4AA con motivo RdRp carente di replicazione è stato utilizzato come controllo negativo.
Il terminale N di nsp9 (in particolare le posizioni 1, 2, 3 e 6) è molto conservato tra i membri della sottofamiglia Orthocoronavirinae (appendice SI, Figura S6).Al fine di studiare il possibile ruolo di questi residui nella NMPilazione di nsp9 mediata da nsp12, due residui Asn consecutivi all'N-terminale di nsp9 sono stati sostituiti con Ala o Ser (da soli o in combinazione).Rispetto a nsp9 wild-type, la sostituzione di N3825 con Ala o Ser ha comportato una riduzione più che doppia dell'UMpilazione mediata da nsp12 (Figura 5C).Coerentemente con la nostra conclusione che la NMPilazione avviene sull'ammina primaria N-terminale invece che sulla catena laterale del residuo N-terminale, abbiamo osservato una significativa NMPilazione residua con la sostituzione di N3825A e N3825S.È interessante notare che, se il secondo Asn viene sostituito da Ala o Ser, la UMPilazione di nsp9 viene ridotta più fortemente (più di 10 volte), mentre la sostituzione di Ala nelle posizioni 3, 4 e 6 ha solo un effetto moderato sulla UMPilazione di nsp9 (Figura 2). ).5C).Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando ATP, CTP o GTP (appendice SI, Figura S8).Collettivamente, questi dati indicano il ruolo chiave di N2826 (posizione 2 in nsp9) nella NMPilazione di nsp9.
Al fine di ottenere ulteriori prove della correlazione funzionale tra l'N-terminale di nsp9 e la NMPilazione, abbiamo eseguito un allineamento di sequenze multiple (MSA) della sequenza nsp9 della famiglia dei Coronavirus (che varia tra 104 e 113 residui) (Appendice SI, Figura S6).In totale, in 47 specie (conosciute e presunte) di 5 generi della sottofamiglia Orthocoronavirinae che infettano diversi mammiferi, uccelli e rettili ospiti, solo 8 residui in totale sono risultati invarianti.I cambiamenti più estesi, comprese delezioni e inserzioni, sono stati osservati nei cicli tra gli elementi della struttura secondaria di nsp9, come determinato da precedenti studi strutturali (26 ??28).Cinque residui invarianti sono stati trovati nel filamento β e nell'elica α della parte C-terminale di nsp9.Tre residui invarianti costituiscono il motivo NNE del terminale N di nsp9.È stato rivelato che il secondo Asn di questo motivo è l'unico residuo invariante, condiviso anche dall'ipotetico nsp9 del coronavirus della rana lontanamente imparentato, e rappresenta la specie Microhyla letovirus 1 nella sottofamiglia Letovirinae di Alphaletovirus.La conservazione dei residui negli elementi della struttura secondaria nsp9 può essere razionalizzata da considerazioni strutturali per mantenere le proprietà di ripiegamento o di legame dell'RNA note.Tuttavia, questo ragionamento non sembra applicarsi alla conservazione della NNE e, prima di questo studio, la natura dei vincoli che limitano la variazione della sequenza tripeptidica era completamente oscurata.
Al fine di determinare l’importanza della nsp9-NMPilazione e della conservazione della NNE nella replicazione del coronavirus, abbiamo prodotto mutanti HCoV-229E, che trasportano sostituzioni singole o doppie dei residui N-terminali di nsp9, indicando che la NMPilazione di nsp9 è dannosa in vitro.Prima di iniziare, proviamo a rispondere alla domanda se queste sostituzioni (vicino al sito di clivaggio nsp8|9) influenzano il processo proteolitico della regione C-terminale pp1a.Una serie di costrutti poliproteici nsp7-11 contenenti sostituzioni corrispondenti all'N-terminale di nsp9 sono stati prodotti in E. coli e tagliati con Mpro ricombinante.La scissione proteolitica dei quattro siti (incluso il sito fiancheggiante nsp9) non è significativamente influenzata da eventuali sostituzioni introdotte (appendice SI, Figura S9), esclusi i cambiamenti strutturali in queste proteine che interferiscono con la scissione nsp8 | 9 mediata da Mpro (o altro) sito web.
Le cellule Huh-7 sono state trasfettate con RNA HCoV-229E della lunghezza del genoma, che codifica per sostituzioni Ala o Ser nei tripeptidi NNE conservati (N3825, N3826 ed E3827) al terminale N sp9, dimostrando che la maggior parte delle mutazioni sono fatali.Siamo riusciti a salvare il virus sostituendo il Ser o Ala dell'Asn N-terminale (N2835A o N2835S), ma non siamo riusciti a recuperare il virus con altre mutazioni singole e doppie nella sequenza NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figura 5D).
Questi risultati indicano che la replicazione dei coronavirus nella coltura tissutale è limitata (uguale o simile), limitando la mutazione naturale dei siti di NMPilazione nsp9 nel corpo e supportando il ruolo chiave di questa risposta nel ciclo di vita dei coronavirus.
Nell'ultima serie di esperimenti, abbiamo prodotto His6 C-terminale marcato SARS-CoV-2 nsp12 e nsp9 e due forme mutanti di nsp12 in Escherichia coli.I residui del sito attivo nei domini NiRAN e RdRp erano invece rispettivamente Utilizzare Ala (Figura 6A e appendice SI, Tabella S2).K4465 in SARS-CoV-2 nsp12 corrisponde a K4135 in HCoV-229E (Appendice SI, Figura S2), che si è rivelato necessario per l'attività NiRAN e la replicazione di HCoV-229E (Figura 3D ed E).Questo residuo corrisponde anche al residuo K94 del virus arterioso EAV nsp9, che in precedenza era stato dimostrato necessario per l'auto-UMPilazione/auto-GMPilazione di NiRAN (16).Come mostrato nella Figura 6B, SARS-CoV-2 nsp12 ha attività transferasi UMP utilizzando nsp9 come substrato, mentre il mutante del sito attivo nsp12_K4465A è inattivo.La doppia sostituzione nella sequenza caratteristica SDD del motivo C RdRp non influenza l'attività della transferasi UMP (Figura 6B), indicando che l'attività RdRp non ha alcun effetto diretto nell'UMpilazione nsp9.Dati simili sono stati ottenuti utilizzando CTP, GTP e ATP (appendice SI, Figura S10).In sintesi, questi dati indicano che la NMPilazione nsp9 mediata da NiRAN ha un’attività conservativa nei coronavirus che rappresentano diversi generi della sottofamiglia degli ortocoronavirus.
NMPilazione mediata da SARS-CoV-2 nsp12 di nsp9.(A) Gel SDS-poliacrilammide colorato con Coomassie che mostra la proteina ricombinante utilizzata nel test di NMPilazione.Come controllo, è stata utilizzata una proteina mutante con sostituzione del sito attivo nel dominio NiRAN (K4465A) e nel dominio RdRp (DD5152/3AA) di SARS-CoV-2 nsp12.La numerazione dei residui si basa sulla posizione in pp1ab.(B) Autoradiografia del rilevamento di UMPylation utilizzando nsp9-His6 e [α-32P]UTP come substrato di nsp12-His6 (wild type [wt] e mutante).La massa molecolare (in kilodalton) della proteina marcata è mostrata a sinistra.
I domini NiRAN sono generalmente conservati nei Nidovirales (16), indicando che catalizzano le reazioni enzimatiche essenziali per la replicazione del Nidovirus.In questo studio, siamo stati in grado di dimostrare che il dominio NiRAN del coronavirus trasferisce l’NMP (generato da NTP) a nsp9, una misteriosa proteina legante l’RNA coinvolta nella replicazione del virus (26 ?? 29), per determinarla come bersaglio naturale e partner del coronavirus RTC.
Il dominio NiRAN condivide tre motivi di sequenza (AN, BN e CN), che contengono un numero molto piccolo di residui conservati in tutte le famiglie nell'ordine Nidovirales monofiletico ma altamente differenziato (8, 16).Studi recenti hanno dimostrato che sono strutturalmente correlati a una famiglia in gran parte non caratterizzata di proteine simili alla proteina chinasi, originariamente chiamate famiglia SelO (17, 19, 22, 30, 31).Le proteine correlate a SelO hanno pieghe chinasiche, ma mancano di diversi residui del sito attivo conservati nelle chinasi classiche (22, 32).Sulla base dell'orientamento inverso delle molecole di ATP legate al sito attivo e stabilizzate da interazioni specifiche, è stato ipotizzato e successivamente confermato che SelO trasferisce AMP (invece di fosfato) al substrato proteico (22), mentre un'altra proteina batterica simile a SelO, YdiU, ha recentemente è stato dimostrato che catalizza l'attacco covalente di UMP a Tyr e ai residui di His di diversi substrati proteici (33).
Al fine di confermare ed espandere la previsione dei presunti residui del sito attivo del dominio NiRAN del coronavirus, abbiamo utilizzato metodi biochimici e di genetica inversa per eseguire l'analisi delle mutazioni sul coronavirus nsp12 (Figura 3D e appendice E e SI, Figura S3 e tabella) S1â S4).I dati mostrano che la sostituzione di HCoV-229E K4135, R4178 e D4280 con Ala elimina l'attività della transferasi NMP in vitro e la replicazione del virus nella coltura cellulare (Figura 3D e appendici E e SI, Figura S3), supportando la loro presenza nell'NTP γ-fosfato (K4135, R4178) e la coordinazione degli ioni metallici del sito attivo (D4280).È stato dimostrato che la sostituzione E4145A del Glu conservato nell'intervallo del virus del nido d'uccello stabilizza la posizione K4135 (17) elimina la replicazione virale, ma sorprendentemente, l'attività è stata mantenuta nel test di NMPilazione in vitro (Figura 3D ed E e Appendice SI, Figura S3 e tabelle S1–S4).Un'osservazione simile è stata fatta quando è stata introdotta la corrispondente sostituzione nell'omologo YdiU di Salmonella typhimurium (E130A) (33).Presi insieme, questi dati supportano la funzione regolatrice di questo residuo conservato piuttosto che la funzione catalitica.
La sostituzione del residuo Phe conservato (F4281A) all'interno dell'intervallo di nestovirus nel dominio NiRAN HCoV-229E (8) ha comportato una diminuzione dell'attività di NMPilazione in vitro e una diminuzione significativa della replicazione del virus nella coltura cellulare (Figura 3D, E e SI) appendice, Figura S3).I dati sono coerenti con l'importante funzione regolatoria di questo residuo, come l'omologo residuo Phe del motivo DFG mostrato in precedenza.Nelle proteine chinasi classiche, fa parte del circuito di legame Mg2+ e aiuta ad assemblare e regolare la colonna vertebrale???Necessario per un'efficace attività catalitica (32, 34).La sostituzione di Ala e Arg con i residui K4116 (nel motivo preAN), rispettivamente, ha eliminato la replicazione virale e, come previsto, ha avuto effetti diversi sull'attività della transferasi NMP in vitro, a seconda della catena laterale dell'amminoacido introdotta (Figura 3D e appendici E e SI , Figura S3).I dati funzionali sono coerenti con le informazioni strutturali, indicando che questo residuo ha stabilito un'interazione con l'ATP fosfato (17).Nel dominio NiRAN di altre famiglie di virus nidificati, la posizione di HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 è occupata da Lys, Arg o His (8), indicando che la restrizione funzionale di questo specifico residuo è stata rilassata.La sostituzione di D4188A e D4283A elimina o riduce fortemente l'attività enzimatica ed elimina la replicazione del virus (Figura 3).Questi due residui sono conservati nella maggior parte (ma non in tutti) dei virus nidificati (8), indicando un'importante funzione familiare specifica ma forse non catalitica.Sostituzioni Ala di diversi altri residui Lys e Asp (K4113A, D4180A, D4197A e D4273A) che non sono conservati nei Coronaviridae o in altre famiglie Nestioviridae (8) sono state utilizzate come controlli.Come previsto, queste sostituzioni sono ampiamente tollerabili, con una leggera diminuzione dell'attività enzimatica e della replicazione virale in alcuni casi (Figura 3 e appendice SI, Figura S3).Nel complesso, i dati sulla mutagenesi del coronavirus sono molto coerenti con i dati di self-GMP e di genetica inversa di EAV NiRAN-RdRp (16), in cui il residuo K94 (corrispondente a HCoV-229E K4135) di EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) svolge funzioni importanti), R124 (corrispondente a R4178), D132 (corrispondente a D4188), D165 (corrispondente a D4280), F166 (corrispondente a F4281).Inoltre, i dati sulla mutagenesi dell'HCoV-229E sono coerenti e ampliati rispetto ai dati di genetica inversa del SARS-CoV precedentemente riportati (16), altrettanto molto simili a quelli osservati per il corrispondente motivo CN, mutante Phe-to-Ala SARS-CoV_nsp12. fenotipo descritto -F219A e HCoV-229E_F4281A (Figura 3 D ed E e appendice SI, Figura S3 e Tabella S1-S4).
Rispetto agli ortologi EAV (16), che hanno una chiara preferenza per UTP e GTP (nella reazione di auto-NMPilazione), il nostro studio mostra che il dominio NiRAN del coronavirus (rappresentato da HCoV-229E e SARS-CoV-2) può essere efficacemente trasferiti Tutti e quattro gli NMP, sebbene vi sia una leggera preferenza per l'UMP (figure 1 e 3).La specificità relativamente bassa del co-substrato specifico NTP è coerente con la struttura supercomposita SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 recentemente segnalata, in cui ADP-Mg2+ si lega al sito attivo di NiRAN, ma non con l'adenina della formazione di interazioni specifiche (17).Nel nostro studio, il tipo di nucleotide utilizzato nella reazione di NMPilazione non ha alcun effetto differenziale sull'attività della proteina mutante (Appendice SI, Figura S3), indicando che nessuno di questi residui è strettamente correlato al legame di una specifica base azotata.Restano da studiare le basi strutturali e il potenziale significato biologico delle diverse preferenze del co-substrato NTP osservate nei domini NiRAN dei coronavirus e dei virus arteriosi;potrebbero essere veri o potrebbero essere dovuti ai limiti dei rispettivi studi.Al momento, non si può escludere che la potenziale attività NMPilatoria del dominio NiRAN del virus arterioso (rispetto all'attività di auto-NMPilazione precedentemente caratterizzata) abbia una diversa preferenza di co-substrato, tenendo conto che la somiglianza tra il dominio arterioso e quello del coronavirus Il dominio NiRAN è al limite.Confronto basato su sequenze (16).Rispetto alla pseudochinasi SelO, che utilizza Mg2+ come cofattore, l’attività del coronavirus e del virus arterioso NiRAN dipende da Mn2+ (16) (Figura 3C e appendice SI, Figura S1).La dipendenza da Mn2+ e l'ovvia preferenza per UTP sono una caratteristica insolita delle proteine NMPylators, e solo recentemente sono state confermate nella proteina YdiU di Salmonella typhimurium, che catalizza la stretta UMPilazione della chaperone proteica Mn2+-dipendente per proteggere le cellule dall'induzione dello stress Pool di ATP cellulare ( 33).
La somiglianza strutturale recentemente descritta tra il dominio NiRAN del coronavirus e le proteine chinasi cellulari (17, 19) fornisce ulteriore supporto alla capacità di NiRAN di collegare covalentemente l'NMP ad altre proteine che abbiamo riportato in questo studio.Abbiamo concentrato la nostra ricerca di possibili target NiRAN sulle proteine codificate da HCoV-229E ORF1a, che sono note per assistere direttamente o indirettamente la replicasi codificata da ORF1b di RTC (12, 35).I nostri esperimenti forniscono prove conclusive dell'efficace e specifica NMPilazione di nsp9 (Figura 2).Se la proteina bersaglio viene utilizzata in un eccesso molare da 8 a 10 volte superiore a quello dell'enzima (nsp12), si conferma che nsp9 è completamente (mono)NMPizzato (Figura 4).Abbiamo concluso che l'interazione tra nsp12 e nsp9 è di breve durata e non formerà un complesso stabile con nsp9 (in assenza di altre subunità RTC).Questa conclusione è supportata da studi di interazione proteica sul proteoma SARS-CoV (35).L'analisi MS ha identificato l'ammina primaria del residuo N-terminale di nsp9 come sito di NMPilazione (appendice SI, Figura S5).La formazione del legame fosforammidato e del gruppo amminico N-terminale distingue l'attività di NMPilazione mediata da NiRAN dalla reazione di AMPilazione mediata da SelO di Pseudomonas syringae, che catalizza la formazione di AMP legato a O nei residui Ser, Thr o Tyr Addotto peptidico ( 22), e S. typhimurium YdiU forma addotti peptide-UMP legati a O (con Tyr) e N-linkati (con His).Le informazioni limitate disponibili sulla famiglia di proteine SelO indicano che i membri di questa grande famiglia di proteine differiscono notevolmente nella formazione di addotti peptide-NMP.Questa è un’osservazione interessante che merita ulteriori approfondimenti.
I dati ottenuti in questo studio ci hanno portato a ipotizzare che la NMPilazione di nsp9 richieda un N-terminale libero.Nel contesto della replicazione virale, ciò sarà fornito dalla scissione proteolitica del sito di elaborazione nsp8|nsp9 nella poliproteina replicasi pp1a mediata da Mpro e pp1ab.Nella maggior parte dei coronavirus, la differenza tra questo sito specifico (VKLQ|NNEI in HCoV-229E) e tutti gli altri siti di scissione Mpro del coronavirus è che Asn (piuttosto che un altro piccolo residuo, come Ala, Ser o Gly) occupa P1â???Posizione (36).I dati di clivaggio del peptide ottenuti nei primi studi hanno mostrato che l'efficienza di clivaggio del sito nsp8|nsp9 era inferiore a quella di altri siti, indicando che 1) questo sito specifico può avere un ruolo regolatore nell'elaborazione tempestiva e coordinata del C-terminale regione pp1a, o 2) a Il ruolo dello speciale N-terminale conservato nsp9 nella replicazione del virus (37).I nostri dati (Figura 5A) hanno mostrato che la forma ricombinante di nsp9 che trasporta la sequenza N-terminale reale è stata effettivamente NMPizzata da nsp12.La sequenza fiancheggiante N-terminale è stata rimossa dal fattore Xa (nsp9-His6; appendice SI, Tabella S1) o scissione mediata da Mpro (nsp7-11-His6; Figura 5A e appendice SI, Tabella S1).È importante sottolineare che il precursore non tagliato contenente nsp9 nsp7-11-His6 ha mostrato resistenza alla NMPilazione di nsp12, che è coerente con i nostri dati, indicando che l'addotto nsp9-NMP è formato attraverso l'ammina primaria N-terminale (appendice SI, Figura S5) .Per acquisire una comprensione più profonda della specificità del substrato NiRAN, ci siamo quindi concentrati sui residui N-terminali adiacenti di nsp9.In assenza di altre proteine, sono strutturalmente flessibili, impedendo loro di essere rilevate nella forma non marcata di nsp9 (26 28, 38), indicando la loro variazione naturale limitata. Ciò è dovuto all'importante sequenza specifica (non correlata alla struttura secondaria) funzione del frammento N-terminale nsp9.Le sostituzioni Ala di residui conservati in questa regione (Figure 5C e D e appendice SI, Figura S8) rivelano che N3826 è essenziale per la NMPilazione di nsp9 in vitro, mentre le sostituzioni N3825A ed E3827A portano ad una diminuzione della NMPilazione, mentre le sostituzioni M3829A e P3830A non lo fanno .Ovviamente influenza la NMPilazione di nsp9.Sebbene la sostituzione dell'Asn N-terminale (N3825A, N3825S) abbia solo un effetto moderato sulla NMPilazione nsp9 e sulla replicazione del virus nella coltura cellulare (Figura 5C e D), l'eliminazione di una sequenza di residui Asn dal dipeptide 3825-NN N-terminale si è rivelato letale per i virus, indicando che è necessario un residuo di Asn prima di un altro residuo all'N-terminale, preferibilmente Asn, sebbene sembri che la sostituzione di residui simili possa essere parzialmente tollerata (Figura 5B, C e D).Concludiamo che il dipeptide 3825-NN, in particolare il residuo N3826 conservato ed essenziale all'interno dell'intervallo del coronavirus (appendice SI, Figura S6), garantisce il corretto legame e orientamento dell'nsp9 N-terminale nel sito attivo di NiRAN.
La sostituzione di Ala (E3827A) con il Glu conservato di tutte le sottofamiglie mantiene la NMPilazione nsp9 in vitro ma è letale per i virus nella coltura cellulare (Figura 5C e D), indicando la funzione aggiuntiva di questo residuo, ad esempio, nelle interazioni chiave (NMPilata o non modificata ) nsp9 N-terminale e altri fattori coinvolti nella replicazione del virus.Le mutazioni di Nsp9 non hanno influenzato il processo proteolitico di nsp9 o di qualsiasi nsps adiacente (39) (Appendice SI, Figura S9), indicando che i fenotipi letali di diverse mutazioni di nsp9 osservate non sono stati causati dalla disregolazione dell'area pp1a del processo proteolitico C terminale. .
I dati di cui sopra forniscono la prova che dopo il trattamento mediato da Mpro del sito di scissione nsp8|9 in pp1a/pp1ab, l'N-terminale di nsp9 può essere UMPylato (o parzialmente modificato con un altro NMP).Inoltre, l'eccellente conservazione dell'N-terminale di nsp9 (compresi i residui Asn singolari e invarianti nella famiglia dei coronavirus) e i dati di genetica inversa ottenuti in questo studio (Figure 3E e 5D) ci hanno portato a concludere che la NMPilazione nsp9 descritta è biologicamente correlato ed essenziale per la replicazione del coronavirus.Le conseguenze funzionali di questa modificazione restano da studiare, ad esempio, per quanto riguarda l'attività di legame dell'RNA nsp9 (forma non modificata) precedentemente descritta (2628).La NMPilazione N-terminale può anche influenzare l'interazione di nsp9 con substrati proteici o di RNA o la formazione di diversi complessi a quattro livelli.Questi sono stati osservati in studi strutturali e si è confermato che sono funzionalmente correlati alla replicazione del coronavirus, anche se soprattutto in assenza di questa modifica (26-ââ29, 40).
Sebbene la specificità target del dominio NiRAN del coronavirus debba ancora essere caratterizzata in modo più dettagliato, i nostri dati mostrano che la specificità target della proteina del dominio NiRAN del coronavirus è molto ristretta.Sebbene la conservazione dei residui chiave del sito attivo (8, 16) nel dominio NiRAN di tutte le famiglie di nidovirus supporti fortemente l'attività dell'NMPylator conservato di queste proteine, l'identità del substrato che lega i residui della tasca di questo dominio Resta da caratterizzare , e possono differire tra le diverse famiglie di scopi Nidovirales.Allo stesso modo, gli obiettivi rilevanti di altri virus nidificati devono ancora essere determinati.Potrebbero essere ortologi remoti di nsp9 o altre proteine, perché le sequenze al di fuori dei cinque domini di replicasi che sono generalmente conservate nei virus nidificati sono meno conservate (8), incluso l'array del genoma tra Mpro e NiRAN. Tra questi, nsp9 si trova nel corona virus.
Inoltre, al momento non possiamo escludere la possibilità che il dominio NiRAN abbia obiettivi aggiuntivi (inclusi quelli cellulari).In questo caso, vale la pena ricordare che gli omologhi batterici in questa proteina emergente NMPylators (NMPylators) (30, 31) sembrano avere “regolatori principali”?L'NMP modula una varietà di proteine cellulari per regolare o eliminare le loro attività a valle, svolgendo così un ruolo in una varietà di processi biologici, come la risposta allo stress cellulare e l'omeostasi redox (22, 33).
In questo studio (Figure 2 e 4 e Appendice SI, Figure S3 e S5), siamo stati in grado di dimostrare che nsp12 ha trasferito la parte UMP (NMP) in una singola posizione (conservata) in nsp9, mentre altre proteine non sono state modificate nel utilizzato Nelle condizioni, è supportata una specificità del substrato ben definita (anziché libera).Coerentemente con questo, rispetto alla NMPilazione di nsp9 N-terminale, l'attività di NMPilazione di nsp12 è molto bassa, il suo rilevamento richiede un tempo di esposizione autoradiografico più lungo e viene utilizzato un aumento di 10 volte della concentrazione di nsp12.Inoltre, la nostra analisi sulla SM non è riuscita a fornire prove di NMPilazione di nsp12, il che suggerisce che l'auto-NMPilazione del dominio NiRAN è (nella migliore delle ipotesi) un'attività secondaria.Tuttavia, va notato che altri studi hanno fornito prove preliminari che lo stato di auto-AMPilazione degli NMPylator batterici può controllare la loro attività di NMPilazione su altri substrati proteici (22, 33).Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per studiare i possibili effetti funzionali delle attività di auto-NMPilazione riportate per EAV nsp9 (16) e coronavirus nsp12 (questo studio), incluso l'effetto simile a chaperone proposto sul ripiegamento del dominio RdRp C-terminale ( 16) ).
In precedenza, sono state prese in considerazione diverse ipotesi riguardanti le possibili funzioni a valle del dominio NiRAN del nidovirus, tra cui RNA ligasi, guanilato transferasi con cappuccio RNA e attività di priming proteico (16), ma nessuna di esse è compatibile con le funzioni a valle disponibili.Le informazioni ottenute nelle seguenti posizioni sono esattamente le stesse senza fare ulteriori ipotesi.I dati ottenuti in questo studio sono molto coerenti (ma non possono dimostrare) che il dominio NiRAN è coinvolto nell'inizio della sintesi dell'RNA indotta dalle proteine.In precedenza si credeva che la funzione del dominio NiRAN in 5??Le reazioni di capping o legatura dell'RNA ²-RNA non sono influenzate da questi e dal supporto di altri dati.Pertanto, ad esempio, si ritiene che il sito attivo di NiRAN coinvolga l'Asp conservato come base generale (D252 in Pseudomonas syringae SelO; D4271 in HCoV-229E pp1ab; D208 in SARS-CoV-2 nsp12) (Appendice SI, figura 2 ).S2) (17, 22, 33), mentre la catalisi nell'enzima RNA ligasi ATP-dipendente e nell'enzima di capping dell'RNA viene effettuata dall'enzima covalente-(lisil-N)-NMP intermedio, che coinvolge un residuo di Lys non modificato ( 41).Inoltre, la notevole specificità basata sulla sequenza del coronavirus NiRAN per i bersagli proteici conservati e la specificità rilassata per i co-substrati NTP (preferisce UTP) si oppone all'enzima di tappatura mediato da NiRAN o alle funzioni simili alla RNA ligasi.
Ovviamente, è necessario molto lavoro extra per verificare e, se dimostrato, elaborare il possibile ruolo di nsp9-UMP (nsp9-NMP) nella sintesi di RNA indotta da proteine, che collegherà diversi rapporti interessanti ma (finora) precedentemente riportati .Osservazioni isolate.Ad esempio, è stato determinato che l’estremità dell’RNA del filamento negativo del coronavirus inizia con un filamento oligo(U) (42, 43).Questa osservazione è coerente con l'idea che la sintesi dell'RNA del filamento negativo viene avviata legando la forma UMPilata di nsp9 alla coda poli(A) (trigger), che può essere promossa dal suo legame con l'RNA. L'attività e/o l'interazione con un'altra proteina RTC.La porzione UMP fornita da nsp9 può quindi essere utilizzata come "primer" per l'oligouridilazione mediata da nsp7/8/nsp12, utilizzando la coda 3??²-poli(A) nell'RNA genomico o un'altra sequenza contenente oligo (A) funge da modello, simile al meccanismo stabilito per la proteina VPg del picornavirus (44).Cosa succede se la proposta è “non normativa”????L’inizio della sintesi dell’RNA del filamento negativo (indotta da proteine) fornisce un collegamento alle osservazioni, indicando che l’RNA del filamento negativo del coronavirus ha UMP (invece di UTP) alla sua estremità (42), il che si ritiene indichi che il l'acido nucleico Dicer scinde l'estremità fosforilata da un'endonucleasi sconosciuta specifica per l'uridina.Se confermata, questa attività idrolitica dell'acido nucleico può aiutare a rilasciare la forma oligomerica UMpilata di nsp9 dall'estremità 5² del nascente filamento negativo.Il possibile ruolo di nsp9 nel priming delle proteine è anche coerente con precedenti studi di genetica inversa, che hanno dimostrato che nsp9 (e nsp8) interagiscono in modo critico e specifico con l’elemento conservato di RNA ad azione cis vicino alla terza estremità del genoma del coronavirus.45).Secondo questo rapporto, queste osservazioni precedenti possono ora essere riesaminate e ampliate attraverso ulteriori ricerche.
In sintesi, i nostri dati hanno determinato l'attività specifica di un tag enzimatico virale annidato proprietario collegato a RdRp all'N-terminale.Nel coronavirus, questa attività UMPylator/NMPylator mediata da NiRAN recentemente scoperta viene utilizzata per fare affidamento su Mn2+ e sui residui Asn adiacenti e causare la formazione di legami fosforammidati (a bassa energia) con l’ammina primaria N-terminale.Attraverso la scissione mediata da Mpro nel sito di scissione nsp8 | 9, il bersaglio nsp9 può essere utilizzato per la NMPilazione, indicando l'accoppiamento funzionale tra la proteasi e il dominio NiRAN, che si estende a RdRp.La conservazione dei residui chiave nel sito attivo NiRAN nsp12 e nel bersaglio nsp9, combinata con i dati ottenuti da due coronavirus tra cui SARS-CoV-2, fornisce una forte prova che la NMPilazione nsp9 è un coronavirus. Le caratteristiche conservatrici sono anche un passaggio chiave nella replicazione del virus.I dati disponibili ci portano a concludere che il ruolo specifico della forma NMPilata di nsp9 nella sintesi di RNA indotta da proteine è uno scenario ragionevole per il coronavirus e altri virus nidificati, e NiRAN può anche prendere di mira altre proteine non identificate.Regolamentare il virus.Interazione con l'ospite.Se confermato, il coinvolgimento dei primer proteici nella sintesi dell’RNA virale aumenterà l’affinità di sequenza dei domini Mpro/3CLpro e RdRp tra il coronavirus precedentemente rilevato e il supergruppo simile al picornavirus (9), che ora sono stati unificati nei Pisoniviriti recentemente stabiliti ( 46) nella categoria.
I nostri dati mostrano anche che le attività enzimatiche di base, selettive e conservatrici identificate in questo studio possono essere utilizzate come bersagli per i farmaci antivirali.I composti che interferiscono con il legame (e la successiva modifica) dell'N-terminale conservato di nsp9 nel sito attivo di NiRAN possono essere sviluppati in farmaci antivirali efficaci e versatili, adatti al trattamento di coronavirus animali e umani di diversi (sotto)generi Infezioni , tra cui SARS-CoV-2 e la sindrome respiratoria mediorientale da coronavirus.
La sequenza codificante della proteina del coronavirus prodotta in questo studio è stata amplificata mediante RT-PCR utilizzando RNA isolato da Huh-7 infetto da HCoV-229E o Vero E6 infetto da SARS-CoV-2 e inserito utilizzando procedure di clonazione standard.Vettore di espressione pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) o pASK3-Ub-CHis6 (47) (Appendice SI, Tabelle S1 e S2).Le sostituzioni di singoli codoni sono state introdotte mediante mutagenesi sito-diretta basata sulla PCR (48).Per produrre la proteina di fusione MBP, le cellule TB1 di E. coli sono state trasformate con l'appropriato costrutto plasmidico pMAL-c2 (appendice SI, Tabella S1).La proteina di fusione è stata purificata mediante cromatografia di affinità con amilosio e scissa con il fattore Xa.Successivamente, la proteina C-terminale marcata His6 è stata purificata mediante cromatografia di affinità metallica immobilizzata con Ni (Ni-IMAC) come precedentemente descritto (49).Per produrre la proteina di fusione dell'ubiquitina, le cellule TB1 di E. coli hanno utilizzato il costrutto plasmidico pASK3-Ub-CHis6 appropriato (Appendice SI, Tabelle S1 e S2) e il DNA plasmidico pCGI che codifica l'idrolasi C-terminale 1 specifica per l'ubiquitina (Ubp1).Trasformazione (47).La proteina del coronavirus marcata con His6 C-terminale è stata purificata come precedentemente descritto (50).
Il test di auto-NMPilazione di HCoV-229E nsp12-His6 è stato eseguito come descritto in EAV nsp9 (16).In breve, nsp12-His6 (0,5 µM) contiene 50 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazinatansolfonico (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitolo (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM di tampone, incubare l'NTP specificato e 0,17 µM corrispondevano a [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) a 30 °C per 30 minuti.In tutti gli altri test (standard) di NMPilazione di nsp9 mediata da nsp12, le condizioni di reazione vengono regolate come segue: nsp12-His6 (0,05 µM) e nsp9-His6 (4 µM) in presenza di 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM indicavano NTP e 0,17 µM corrispondevano a [α32-P]NTP.Dopo aver incubato per 10 minuti a 30°C, il campione di reazione è stato miscelato con il tampone campione SDS-PAGE: 62,5 mM tris(idrossimetil)amminometano HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glicerolo e 0,005% bromofenolo blu.La proteina è stata denaturata mediante riscaldamento a 90°C per 5 minuti e separata mediante SDS-PAGE al 12%.Il gel viene fissato e colorato con la soluzione Coomassie Brilliant Blue (40% metanolo, 10% acido acetico, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), decolorato ed esposto a uno schermo per imaging fosforescente per 20 ore (per rilevare nsp12 dalla NMPilazione) o (massimo) 2 ore (per valutare la NMPilazione di nsp9).Un imager Typhoon 9200 (GE Healthcare) è stato utilizzato per scansionare lo schermo e ImageJ è stato utilizzato per analizzare l'intensità del segnale.
Per l'analisi MS, 1 µM nsp12-His6 e 10 µM nsp9 (senza tag esahistidina) sono stati utilizzati nell'analisi di NMPilazione (appendice SI, Tabella S1) e è stata utilizzata la concentrazione aumentata di 500 µM UTP e GTP.A seconda della concentrazione e della qualità proteica prevista, è stato utilizzato un sistema HPLC Waters ACQUITY H-Class dotato di colonna MassPrep (Waters) per dissalare online da 1 a 10 µl di soluzioni proteiche tamponate.La proteina dissalata viene eluita nella sorgente ionica elettrospray dello spettrometro di massa Synapt G2Si (Waters) attraverso il seguente gradiente di tampone A (acqua/0,05% acido formico) e tampone B (acetonitrile/0,045% acido formico) e la temperatura della colonna è 60 °C e una portata di 0,1 mL/min: eluizione isocratica con 5% A per 2 minuti, quindi un gradiente lineare al 95% B entro 8 minuti e mantenimento del 95% B per altri 4 minuti.
Vengono rilevati ioni positivi con un intervallo di massa compreso tra 500 e 5000 m/z.Il glu-fibrinopeptide B viene misurato ogni 45 secondi per la correzione automatica della deriva di massa.Utilizzare il software dello strumento MassLynx con estensione MaxEnt1 per deconvolvere lo spettro medio dopo aver dedotto la linea di base e il livellamento.
L'HCoV-229E nsp9 UMPylato è stato digerito aggiungendo trypsin modificato di grado sequenziamento (Serva) e incubato per una notte a 37 °C.Per dissalare e concentrare i peptidi è stata utilizzata una colonna spin Chromabond C18WP (codice articolo 730522; Macherey-Nagel).Infine, il peptide è stato sciolto in 25 µL di acqua, che conteneva il 5% di acetonitrile e lo 0,1% di acido formico.
I campioni sono stati analizzati mediante MS utilizzando uno spettrometro di massa Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).L'ultimo sistema nanoâ HPLC (Dionex), dotato di un terminale personalizzato da 50 cm??Colonna C18 RP da 75 μm impaccata con sfere magnetiche da 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Collegare allo spettrometro di massa online tramite la sorgente nanospray Proxeon;iniettare 6 µl di soluzione di digestione della trypsin in un diametro interno di 300 µm ×??Colonna di preconcentrazione C18 PepMap da 1 cm (Thermo Scientific).Utilizzando acqua/acido formico allo 0,05% come solvente, il campione è stato automaticamente intrappolato e desalinizzato a una portata di 6 µL/min.
I seguenti gradienti di acqua/0,05% acido formico (solvente A) e 80% acetonitrile/0,045% acido formico (solvente B) sono stati utilizzati per ottenere la separazione dei peptidi triptici a una portata di 300 nL/min: 4% B per 5 minuti, quindi 30 A di gradiente lineare al 45% di B in pochi minuti e un aumento lineare al 95% di solvente B entro 5 minuti.Collegare la colonna cromatografica a un nanoemettitore in acciaio inossidabile (Proxeon) e spruzzare l'eluente direttamente nel capillare riscaldato dello spettrometro di massa utilizzando un potenziale di 2.300 V. È associata la scansione di rilevamento con una risoluzione di 60.000 nell'analizzatore di massa Orbitrap con almeno tre scansioni MS/MS di dati, escluse dinamicamente per 30 secondi, utilizzando la dissociazione indotta da collisione con trappola ionica lineare o la dissociazione da collisione a energia più elevata combinata con il rilevamento orbitrap. La risoluzione è 7.500.
Orario di pubblicazione: 03-ago-2021